针对动物细胞培养连续生物工艺的灌流培养基开发
本文节选自《Perfusion Medium Development for Continuous Bioprocessing of Animal Cell Cultures》，详细内容，请参考原文。
哺乳动物细胞培养的传统生物工艺是批次或补料分批模式。为了提高空间-时间产量，降低商品成本，加快上市时间，并在降低实验室占地面积的情况下提高灵活性，灌流工艺被开发用于各种生物工艺强化任务。动态灌流的目标是通过在较长时间内保持较高的特异性生长率来达到高活细胞密度(VCD)，其通常在高灌流速率下操作，以产生构建高密度冻存细胞库所需的生物量，或作为N-1阶段的接种液，用于更大规模的、以（强化）补料分批或浓缩补料分批操作的生产生物反应器的接种。动态灌流操作可以转换为连续、稳定的低灌流速率灌流培养，形成持续数周甚至数月的高VCD灌流培养，以高效、高质量地生产产品。根据灌流操作的具体目标，合适的培养基应能支持最高的生长或产率。
灌流培养基和工艺条件的最佳组合可提高活细胞密度和活细胞密度积分(IVCD，也就是细胞天数)，使其远远超过批次培养所能达到的水平(图1A)。当细胞特异性产率(qP)可以保持时，更高的IVCD可以显著提高可获得产物产量（图1B)。最大的挑战之一是营养物质的累积消费以及有毒废物的生产，例如葡萄糖和乳酸(图1 C和D)。IVCD-曲线的斜率允许深入洞察细胞性能以及表示常见的细胞培养参数，包括细胞特异性增长(μ)、产率(qP)、葡萄糖消耗(qGluc)和乳酸生产(qLac)。
灌流培养的营养水平可以控制为两个水平。第一，通过培养基组成，以及第二，通过相较于补料分批优化的、进入生物反应器的补液。一个显著的区别是，在灌流过程中，产物以及有毒副产品通过调节耗竭培养基的连续液流而被从培养中去除，但在补料分批工艺中，毒性副产物滞留在培养罐内，且产物暴露于细胞死亡所释放的酶。因此，必须针对给定的细胞系和相应的培养基，开发平衡的灌流流速，以提供足够的营养物质，并有效地清除有毒代谢废物。
作为高性能灌流培养基关键标志的低细胞特异性灌流速率（CSPR）的概念
优化的灌流培养基可在最小灌流速率下支持健康的细胞生理。新培养基的一个典型设计目标是达到最低的细胞特异性灌流速率(CSPR)，以降低总体的培养基消耗，提高收获滴度，减少储槽尺寸和实验室占地面积。实际上，CSPR描述的是每个细胞每天的灌流培养基体积。已有文献介绍过最低为20 pL/cell/day的CSPR。一个平均直径为13 μm的球形CHO细胞确定为1 pL的细胞质，这意味着在20 pL/cell/day的CSPR条件下，超过20倍细胞体积的培养基通过反应器。进一步假设快速生长的细胞的葡萄糖消耗速率高达400 pg/cell/day，我们的灌流培养基必须在20 pL培养基中提供400 pg葡萄糖，即可翻译成20 g/L的葡萄糖浓度。如果我们将灌流速率提高到40 pL/cell/day，我们的培养基中只需要包含10g /L的葡萄糖，而如果我们想将CSPR降低到10 pL/cell/day，则我们必须提供40 g/L的葡萄糖。这种计算也适用于有毒废物成分。我们观察到，快速生长的细胞可以产生高达50 pg/cell/day的乳酸。在灌流速率为20 pL/cell/day的情况下，最终乳酸浓度为2.5 g/L。如果我们将CSPR降低到10pL/cell/day，则提高为5 g/L乳酸，或在更高灌流速率(40 pL/cell/day)时降低为1.3 g/L。高产率的重组细胞系可以产生高达20 pg /cell/day的重组蛋白。当CSPR为10、20和40 pL/cell/day时，滴度分别为2、1和0.5 g/L。
当我们在灌流培养中将最低CSPR推到边界值时，我们必须使用高度浓缩的培养基，并仔细考虑到较低的冲洗和有毒代谢物的临界浓度。此外，在更低的灌流速率条件下，蛋白产物的滞留时间增加。对于稳定的产品，如抗体，更低的灌流速率可能是有益的的，收获液中的滴度会提高，使灌流成为使用紧凑且便携的一次性使用设备强化生物工艺的一个非常有吸引力的概念。开发用于低CSPR操作的高浓度灌流培养基也允许我们应用恒化器模式。与细菌相比，哺乳动物细胞的特异性生长率较低，因此运行恒温器需要更低的稀释率。
利用现有的平台培养基，设计新的灌流培养基
与传统的批次工艺相比，细胞培养基更“深刻”地决定了灌流培养的性能、最终的产物产量和产物质量。细胞培养基的设计是为了改善细胞生理(生长和生产)，获得适当的理化性质(粘度、减少泡沫、适当的溶氧、pH值和缓冲容量等)以及稳定性(储存、保质期、降解)。所谓的平台培养基是针对上游工艺的多个步骤开发的，包括复苏、常规培养、生物质扩增、生产和低冻存。如今，人们可以通过广泛的基础培养基和不同的补液添加物，来获得均衡的碳水化合物、氨基酸、脂类、维生素、有机酸和微量元素。
在过去，这种现成的培养基通常是专门针对传统的补料分批应用而设计的，而且在过去几十年里积累了大量关于培养基成分如何影响细胞培养的知识。现在，我们的任务是将这一广泛的知识体系结合起来，并将其用于新的生物工艺。一种策略是利用现有的平台培养基，并与某些添加物结合，以进行灌流。在补料分批工艺中，有必要通过精确定时添加高浓度补液溶液来提供均衡的营养物质，以保持低培养渗透压。营养物是通过每天的补液或连续补液来维持的，但是有毒的副产品会累积并滞留在培养体系中。通过A)高度浓缩的补液溶液的组成和B)确定最佳补液方案来实现优化。相比之下，灌流培养基通过连续的补液液流输送营养物质，并同时清除有毒废物。因此，灌流工艺的发展包括:A)优化灌流培养基的组成；B)确定最佳灌流速率。尽管在培养基组成和工艺控制方面存在差异，平台培养基的有益特性可以横跨多种操作模式而进行转移，并对于连续灌流或恒化器培养只需进行微调。
灌流培养基开发的支持性技术
虽然有各种复杂的培养基和补液溶液可用，而且对于专门设计的新的灌流培养基，可以使用现成的产品作为设计的起点，但要找到一个在营养物质、渗透压、pH值、缓冲容量、O2/CO2溶解性最佳、且需在高细胞密度条件下使用的灌流培养基，仍需要筛选大量的参数。为了成功地完成这一复杂的任务，需要多因素方法和工具来找到全局最优方案。
传统的细胞培养基设计方法包括合理性方法，如通过对耗竭培养基的分析，来确定限制性或有毒化合物的浓度，以及经验性方法，如通过培养基混合，来结合多种培养基溶液的优势。通过HPLC、GC、LC-MS和GC- MS或NMR- 和RAMAN光谱进行分析，可以帮助识别灌流收获液中不需要的高营养物浓度，以及检测生理条件下的营养物稳态。
与传统的一次一因素(OFAT)方法相比，实验设计(DoE)与响应面模型相结合已被证明在鉴定最佳“因素”(即底物)、其“水平”(即浓度)和“因素相互作用”方面具有特别的优势。此外，当许多不同的因素和水平需要筛选和优化时，DoE降低了实验成本，并从有限的实验中提取最大的信息。
对大量不同培养条件进行研究需要应用许多平行培养，这些培养可以使用最少的资源在小体积、高通量条件下进行操作。稳健且可重现的小规模模型通常开发用于批次和补料分批应用，但现在也被应用于灌流工艺，以模拟大型生物反应器培养的性能，并预测关键参数，包括细胞产率、蛋白质质量和关键工艺参数，如最低CSPR或最佳每日废弃体积。与批次/补料分批模型不同，连续的培养基添加和收获去除必须通过适当的技术来实现，包括有效的细胞截留或控制细胞废弃。由于更高的复杂性且缺乏合适的小规模细胞截留装置，目前只有有限数量的小规模概念和微型生物反应器可用。小规模模型最好是在几毫升的工作体积下操作，以减少总体培养基消耗。这意味着在连续操作时，必须应用非常低的培养基流速。对于10mL工作体积、1VVD的每日灌流速率，模型必需支持低至7 μL/min的流速。对于使用连续培养基液流的真正管理与，这需要适当的微流系统。另一种方法是在规定的时间间隔内进行液体输送。例如，使用0.5 mL/min的小型蠕动泵可以实现平均每天10mL的灌流体积，即每6小时运行5分钟，或者每天运行20分钟。然而，在这种半连续培养中，偏离真正连续要求的灌流操作会导致峰值滴度和代谢产物的波动，这可能会显著影响细胞行为以及最终产物质量，必须仔细评估。
半连续灌流培养被定义为每日培养基置换，即使用离心方法分离细胞培养上清液，以在简单的摇管或烧瓶中模拟灌流，这些都是任何细胞培养实验室现成拥有的。这种有效的培养模式由一个操作员“高通量”地操作,为灌流培养提供了一种极具吸引力的小规模替代方法。然而，标准的摇管通常不会配备pH和溶氧(DO)传感器和控制器。因此，最近正在努力开发更复杂的微型生物反应器，以在非常小的工作体积 (50-200ml)下进行真正的连续灌流操作，并进行适当的DO和pH控制。
挑战与未来方向
一旦通过合理或经验方法，使用适当的小规模模型，确定了合适的灌流培养基，最终的培养基必须满足质量、稳定性和可制造性方面的多个属性。从可操作性方面考虑，倾向于粉状配方的培养基，以延长货架寿命，减少存储体积且方便运输到不同的地方。需要开发针对所有成分液体复溶的方法，这可能包括成粒的中等粉末，以加快在大规模条件下的水化时间。需要长时间(稳态)灌流运行的大量培养基可以通过现场稀释浓缩培养基的方式来提供，以减少所需的存储和实验室空间。应采用适当的方法检测、监测和控制由热能和光能等引起的培养基降解，包括光谱(拉曼)方法和化学计量工具。
高度富集的灌流培养基支持非常低的CSPR，可至20-40 pL/cell/day，但这带来了两个挑战:首先，对于小规模模型，在连续操作中使用微流系统需要非常低的流速。或者，使用传统蠕动泵，在确定的时间间隔内运行。第二，在低灌流速率条件下，有毒副产物会累积。因此，必须鉴定所有有毒细胞代谢物，了解它们的代谢网络，最终通过细胞(代谢)工程、培养基设计或工艺控制，来控制它们的生物合成。
最近的培养基设计方法也旨在包括系统生物学的方法，以更详细地了解培养环境对细胞生理的影响。多种组学技术可用于支持传统培养基的开发。我们利用转录组学研究了补液添加物对高产细胞系的影响。此外，代谢流量分析或细胞蛋白质组的表征是非常适合使用的概念，可以通过产品和细胞特异性的方式设计培养基，以理解和调整细胞生理。新的方法旨在通过使用化学计量或动力学模型的机械建模，在硅（in-silico，在计算机）设计培养基。事实上，生产滴度的显著增加将在不久的将来挑战培养基的开发，以优化产品质量，比如对于抗体，电荷、大小和糖型分布被定义为关键的质量属性。
原文：P.Mayrhofer, R.Kunert, Perfusion Medium Development for Continuous Bioprocessing of Animal Cell Cultures. 2020.
相关阅读：